『壹』 實時熒光Taqman 探針設計的幾個要點
熒光探針法是用序列特異的熒游標記探針來檢測產物,探針法的出現使得定量PCR技術的特異性比常規PCR技術大大提高。目前較常提及的有TaqMan探針、FRET雜交 探針(熒光共振能量傳遞探針)和分子信標Molecular Beacon。
廣泛使用的TaqMan探針法是指PCR擴增時在加入一對引物 的同時另外加入一個特異性的熒光探針,該探針只與模板特異性地結合,其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有熒光報告基團(Reporter, R),如FAM、VIC等,3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q),如TAMRA等。當探針完整的時候,5′端報告基團經儀器光源激發的熒光正好被近距離的3′端熒光基團淬滅,儀器檢測不到5′端報告基團所激發的熒光信號(就是說5』熒光基團的發射波長正好是3』 熒光基團的吸收波長,因而能量被吸收傳遞到3』熒光基團而發出其它熒光)。隨著PCR的進行,Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針,其5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的,游離的單鏈探針不受影響)就會將切割探針,釋放5′端報告基團游離於反應體系中,遠離3′端熒光淬滅基團的屏蔽,5′端報告基團受激發所發射的熒光信號就可以被探頭檢測到。也就是說每擴增一條 DNA 鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。
(請注意,該圖顯示的不是普通的Taqman探針法,而是Taqman MGB探針法)Taqman探針檢測的是積累熒光。常用的熒光基團有FAM,TET,VIC,HEX等等。當探針完整的時候,由於3′端的熒光淬滅基團在吸收5′端報告基團所發射的熒光能量,本身會發射波長不同的熒光而導致本底高,因此TaqMan探針近來又有新的發展——TaqMan MGB探針。MGB探針的淬滅基團採用非熒光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher),本身不產生熒光,可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團,可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值,MGB探針可以比普通TaqMan探針設計得更短,既降低了合成成本,也使得探針設計的成功率大為提高——因為在模板的DNA鹼基組成不理想的情況下,短的探針比長的更容易設計。實驗證明,TaqMan MGB探針對於富含A/T的模板可以區分得更為理想。
Taqman探針法已經得到廣泛使用,不過有人認為這種技術利用了Taq酶5 —3 外切酶活性,一般 試劑 廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標,沒有同時給Taq酶5 —3 外切酶活性定標,不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度(Tm)僅要求其高於60°C,這就使不同 試劑盒 之間的特異性參差不齊,難於做質控檢測。
Real time PCR Taqman探針設計、實時多重PCR探針的選擇和引物的設計及評價
一、實時熒光Taqman 探針設計
總原則:探針選擇要保守,引物選擇要保守,因此必須找一段100-200bp相對要保守的片段來設計引物與探針。即real-time PCR的擴增片段是50bp----150bp。當找不到150bp的保守片段時,必須確保探針的片段是保守的。
在設計探針和引物時,要同時考慮在兩條鏈上設計引物與探針。但要注意的是:在那條鏈上設計探針時,就應靠近在同一條鏈上設計的引物(即上游引物)。這樣,可保證在將來擴增時,即便沒有完全擴增,也有熒光信號報告出來。兩者的距離最好是探針的5』端離上游引物的3』有一個鹼基,但也可以重疊。
若在原序列中找不到合適的探針與引物(1主要是探針和上游引物的距離太遠,而離下游引物的距離卻較近時;2 突變 位點要求在探針的5』 端也能檢測到熒光信號,但卻是在3』端),可在互補的序列中設計引物與探針。
另real-time PCR中的探針和引物的Tm值,均要高於平常PCR的引物和雜交的探針的Tm值。
二、 探針的設計
探針設計的基本原則:
1. 保守:探針要絕對的保守,有時分型就單獨依靠探針來決定。理論上有一個鹼基不配對,就可能檢測不出來。若找不到完全保守的片段,也只能選取有一個鹼基不同的片段。且這個不同的鹼基最好在探針的中間,對探針與目的片段的雜交影響不大,不相同的鹼基最好不要在兩端,因為兩端不利於探針的雜交。且最好為A或T,而不能為G或A,因為A、T為雙鍵,而G、A為三鍵。
2. 探針長度:Taqman探針的長度最好在25-32bp之間,且Tm值在68-72℃之間,最好為70℃,確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出10℃,這樣可保證探針在煺火時先於引物與目的片段結合。因此探針最好是富含GC的保守片段,保證其的Tm值較高。現在有Taqman MGB探針,在TAMER之後再標記一個MGB,可使探針的Tm值較高,即使探針片段較短,也可達到Taqman探針的Tm值要求(68-70℃)。
3. 探針的名稱:應標記探針在 基因 組的位置及長度。
4. 探針Tm值計算: 用oligo或primer preiemer軟體即可計算Tm值。確保探針中GC含量在30-80%。應避免探針中多個重復的鹼基出現,尤其是要避免4個或超過4個的G鹼基出現。
5. 探針的評價:用DNAstar軟體中的Primerselect軟體,點擊「log」菜單中的「create primer catalog」,在「name」中輸入探針的名稱、位置,按Tab鍵進入「sequence」,粘貼或輸入要分析的探針序列。選中整個序列後,在 「report」菜單下「primer self dimer」,分析探針的二聚體。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個dimer,並對此探針用dG值進行評價(通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好)。在「report」菜單下「primer hairpins」,分析探針的發夾結構。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個hairpins,並對此探針的hairpins進行評價。多重熒光PCR 時,要對多條探針進行「pair dimer」進行分析。
6. 探針的5』端不能為G,因為即使單個G鹼基與FAM熒光報告基團相連時,G可以淬滅FAM基團所發出的熒光信號,從而導致假陰性的出現。
7. Taqman探針與引物之間的位置:Taqman探針應靠近上游引物,即Taqman探針應靠近與其在同一條鏈上的上游引物。兩者的距離最好是探針的5』 端離上游引物的3』有一個鹼基,但也可以重疊,要保證Taqman探針的5』端離上游引物的5』端至少有4bp。
如:
forward primer Taqman probe
5』 → 3』 5』 FAM→3』染料
NNNNNNN NNNNNNN
發表序列:5』--3』
互補發表序列 3』--5』
NNNNNNN
3』 ←5』
reverse primer
或:
reverse primer
5』 → 3』
NNNNNNN
發表序列: 5』--3』
互補發表序列 3』--5』
NNNNNNN NNNNNNN
料染3』 ← MAF5』 3 』← 5』
Taqman probe forward primer
Taqman probe forward primer
三 引物的設計
1. 上下游引物要保守
為了能夠擴增出所需要的保守片段,必須對保守的100-200片段進行PCR擴增。所以引物的選取也要非常的保守,最好不要有不同的鹼基,若不得不有時,也必須保證引物的3』端至少有4個鹼基是完全保守才可。
在設計保守引物時,要在發表序列上分別找保守一致的區域,即在發表序列的5』端引物位置找的是3』端至少有5個bp保守,在即在發表序列的3』端引物位置找的是5』端至少有5個bp保守。
5』NNNNNNN 3』
發表序列:5』--3』
3』NNNNNNNNN 5』
2. 上下游引物的長度和Tm值
上下游引物的長度一般為18-25bp之間,且Tm值在58-60℃之間。確保引物中GC含量在30-80%。應避免引物中多個重復的鹼基出現,尤其是要避免4個或超過4個的G鹼基出現。引物的3』端最好不為G或/和C。引物3』端的5個鹼基不應出現2個G或/和C。
上游引物應標記F(forword),且在 基因組 的位置及長度;下游引物應標記R(reverse),且在基因組的位置及長度。用oligo或 primer preiemer軟體即可計算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超過2℃,長度相差最好不超過4bp。
3. 引物的評價
用DNAstar軟體中的Primerselect軟體,點擊「log」菜單中的「create primer catalog」,在「name」中輸入引物的名稱、位置,按Tab鍵進入「sequence」,粘貼或輸入要分析的引物序列。選中整個序列後,在 「report」菜單下「primer self dimer」,分析引物的二聚體。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個dimer,並對此引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好)。在「report」菜單下「primer hairpins」,分析引物的發夾結構。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個hairpins,並對此引物的hairpins進行評價。再選擇所需要的上下游引物,在「report」菜單下「primer pair dimers」,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer,並對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好(dG值通常為負值),絕對值超過4.5kcal/mol易導致產生引物二聚體帶,並且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行)。不必考慮引物與探針之間的配對與發夾結構,因為探針的Tm值非常之高。
4. 上下游引物與探針的距離(上下游引物的位置)
理論上講,上游引物的3』端離探針的5』端為1-20bp,最佳是1bp,最近為上游引物的3』端離探針的3』端為4bp;下游引物要與探針有一定的距離,但要保證下游引物的3』端離探針的3』端最為15-150bp。整個目的片段的長度最好在50-150bp之間,最長不超過200bp。
5. 簡並引物的設計
當為了能夠同時擴增即使在引物位點也有突變的目的片段,若多個鹼基出現的概率相同,就要在此位點,設計一個代表多個鹼基的簡並子。在合成引物時,在合成到此位點時,就不是加入一個鹼基,而是同時加入簡並子所代表的多個鹼基。這樣,實質合成的引物是多條引物,只不過是在簡並子位置鹼基不同而已。但簡並引物要考慮每條引物的Tm值,確保簡並子所代表的不同鹼基的不同引物Tm值相差不超過2℃。若超過2℃,在確保引物的3』端引物相同時,在Tm值較低的鹼基引物的5』端加入幾個鹼基,使其的Tm值相同。但這時就不是簡並引物,而是分別合成長度不同,簡並子位點鹼基不同,但Tm值相同的兩條引物,最後在進行等濃度的混合即可。
5』 → 3』
NNNANNN
NNNGNNN
序列:5』-NNNNNNNNNA/GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3』
R
R
四、 實時多重PCR探針的選擇
1.多重實時PCR的多種含意有兩種:一為選擇保守的探針和引物,利用不同的染料標記探針,在檢測時可根據熒光的顏色來判定不同的產物。另一種為選擇保守的引物,擴增不同長度的目的片段,反應中加入SYBRN染料,最後根據不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。
2.多重實時PCR的熒光探針應為同一類型:如同時為Taqman 探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon 探針。
3.MGB探針的優點
a.MGB探針較短(14-20bp),更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區。
b.短片段探針(14-20bp)加上MGB 後,Tm值將提高10℃,更容易達到熒光探針Tm值的要求。
4.MGB探針的設計原則
1)探針的5』端避免出現G,即使探針水解為單個鹼基,與報告基團相相連的G鹼基仍可淬滅基團的熒光信號。
2)用 primerexpress軟體評價Tm值,Tm值應為65-67℃。
3)盡量縮短Taqman MGB探針,但探針長度不少於13bp。
4)盡量避免出現重復的鹼基,尤其是G鹼基,應避免出現4個或4個以上的G重復出現。
5)原則上MGB探針只要有一個鹼基突變,MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交,不產生熒光信號)。因此,在進行SNP檢測時,為了檢測到突變子,即Taqman MGB不與目的片段雜交,不產生熒光信號,探針目的片段產生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。注意:為了滿足上述要求的4個條件,探針的突變位點可向3』端移動,但突變位點至少在離3』端2個鹼基的前方(即必須確保探針的後兩個鹼基是絕對的保守),以進行SNP檢測。反過來,若要進行同類檢測,找的是保守片段區,探針中不應有突變位點。若探針即便是只有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變,突變位點也應靠近探針的5』端,這樣,即便是突變,探針也可與目的片段雜交,產生熒光信號。另一種方法是設計簡並探針,也可達到即使是突變,仍可檢測到突變。
5.在多重PCR中,多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析
設計好各對引物和探針後,重新在用DNAstar軟體中的Primerselect軟體,打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件,然後兩兩分別選中所設計的多重引物或兩兩分別選中所設計的多重探針後,在「report」菜單下「primer pair dimers」,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer,並對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值,理論上是dG值越大越好)。
6.多重實時熒光PCR擴增片段影響
最好每重擴增相同長度的目的片段,但長度不以相差太大。
7.同種亞型明顯分為幾群,而又想同時擴增整個亞型的引物與探針設計策略。
先對各個亞群設計各自保守的引物與探針,然後探針用同一染料標記,這樣在實時PCR反應中,雖然是多重PCR反應,但報告卻是同一個染料報告。
採用熒游標記探針檢測產物的特異性比較強,TaqMan探針是熒光定量PCR中常用的熒光探針,一般TaqMan探針5′端的熒游標記基團是FAM、VIC等,TaqMan探針3′端熒游標記集團為TAMRA、Quencher等
參考:丁香園